编者按

中药复方仙黄方（Xian Huang Fang, XHF）在临床上常用于慢性肾脏病（CKD）的治疗，具有保护肾功能、延缓疾病进展的作用。然而，其抗肾间质纤维化（RIF）的具体分子机制尚不明确。上海中医药大学附属曙光医院课题组对此进行了探索，研究发现，XHF通过抑制PKCδ/MAPK信号通路，减轻肾小管上皮细胞衰老，从而延缓肾间质纤维化。该研究近期已在线发表于Drug Des Devel Ther.。

研究背景

慢性肾脏病（CKD）是全球非传染性疾病发病率和死亡率上升的重要因素之一。肾间质纤维化（RIF）是多种CKD进展的共同病理途径和主要表现。肾小管上皮细胞（RTECs）作为肾小管间质的主要细胞成分，在损伤后修复能力下降，表现为细胞周期停滞、部分上皮-间质转化（EMT）以及病理性细胞衰老。缺氧、代谢应激和持续性损伤等因素均可诱导RTECs进入衰老状态。目前尚缺乏有效阻止肾小管损伤和纤维化的治疗策略，因此亟待开发靶向病理性细胞衰老等关键驱动因素的新型治疗策略。

细胞衰老不仅是衰老的结果，更是推动CKD进展中纤维化的重要驱动因素。衰老细胞通过分泌衰老相关分泌表型（SASP）因子，如IL-6、TGF-β1等，形成有害微环境，促进炎症反应、成纤维细胞活化和细胞外基质（ECM）沉积，从而加速RIF进展。MAPK家族成员（p38、ERK、JNK）等上游激酶可调控SASP活性，因此靶向调控病理性衰老的信号通路有望中断CKD中炎症与纤维化的恶性循环。

仙黄方（XHF）由大黄（Rheum palmatum）和淫羊藿（Epimedium）组成，是中医药用于治疗CKD的临床常用配伍。其生物活性成分淫羊藿苷（来自淫羊藿）和大黄素（来自掌叶大黄），已被证实具有抗炎、抗氧化和抗纤维化特性。上海中医药大学附属曙光医院研究团队的前期探索发现，淫羊藿苷可通过抑制成纤维细胞活化减轻肾纤维化，大黄素则通过抑制EZH2改善梗阻性肾病中的肾小管间质纤维化。然而，XHF是否通过调控细胞衰老这一关键病理过程来抗纤维化，其分子机制尚不明确。

因此，上海中医药大学附属曙光医院课题组开展研究，探讨了XHF是否通过靶向病理性细胞衰老缓解肾间质纤维化。他们结合网络药理学预测PKCδ为核心靶点，并在体内外模型中验证其作用，进一步阐明XHF抗纤维化与抗衰老之间的分子联系。

研究方法

研采用超高效液相色谱-四极杆-轨道阱高分辨质谱（UHPLC-Q-Orbitrap HRMS）对复溶的XHF冻干粉进行化学成分分析。通过5/6肾切除（A/I）建立慢性肾衰竭模型，使用5 ng/ml转化生长因子β1（TGF-β1）诱导人肾小管上皮细胞（HK-2）纤维化。采用网络药理学、组织病理学、蛋白质印迹法、免疫荧光（IF）及衰老相关β-半乳糖苷酶（SA-β-gal）染色等方法评估其作用机制。

研究结果

1.XHF化学成分分析

XHF由15 g掌叶大黄和15 g淫羊藿组成。将煎剂混合物冷冻干燥成标准粉末。采用UHPLC-Q-Orbitrap HRMS进行化学分析（图1），鉴定出XHF中6种特征成分：芦荟大黄素、大黄素、大黄酸、大黄酚、大黄素甲醚和淫羊藿苷。

图1. XHF的UHPLC-Q-Orbitrap HRMS分析

2.XHF改善5/6（A/I）肾切除诱导的肾纤维化进展

通过5/6肾切除（A/I）建立大鼠CKD模型，随后用不同剂量的XHF和氯沙坦（LOS）处理大鼠8周。结果显示，XHF治疗显著降低模型大鼠血清Scr、UACR、IL-6和TNF-α水平（图2A–D）。组织染色显示XHF治疗显著减轻肾小管损伤、炎症浸润和胶原纤维沉积（图2E）。Westernblot分析结果显示XHF下调纤维化标志物纤维连接蛋白（FN）、vimentin、α-SMA表达（图2F–I），并显著恢复钠钾ATP酶β1亚基（ATP1B1）和水通道蛋白1（AQP1）的表达（图2L和M），提示其改善肾小管功能。

图2. XHF改善5/6（A/I）肾切除诱导的CKD大鼠的肾纤维化并调节水通道蛋白表达。*P<0.05，**P<0.01，与假手术组相比；#P<0.05，##P<0.01，与5/6（A/I）组相比。假手术组：假手术组；5/6（A/I）：模型组。

3.网络药理学分析提示PKCδ为核心靶点

共筛选出119个XHF与CKD共同靶点，基于这些靶点构建的蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络分析显示，蛋白激酶Cδ（PKCδ）为核心靶点（图3A–B）。KEGG富集分析提示AGE-RAGE、MAPK等通路可能参与XHF作用（图3C–D）。换言之，XHF主要通过PKCδ信号通路，同时抑制纤维化相关通路，来改善肾纤维化和延缓慢性肾脏病进展。

图3. XHF在慢性肾脏病中的共同靶点和功能富集分析。（A）共鉴定出119个XHF和慢性肾脏病之间的重叠蛋白靶点。（B）蛋白质-蛋白质相互作用网络。（C）前20个KEGG的富集结果。（D）基因本体论术语富集。顶级生物学过程（BP，上部）；顶级细胞组分（CC，中部）；顶级分子功能（MF，下部）。

4.XHF通过抑制PKCδ/MAPK信号通路改善肾纤维化

研究人员进一步探索了XHF是否能减轻HK-2损伤及TGF-β1诱导的纤维化表型。结果发现，在TGF-β1诱导的HK-2细胞中，XHF和PKCδ抑制剂Rottlerin（1μM）均能有效改善以增殖抑制和纤维化为特征的双重表型（图4C–H）。

在该模型中的实验验证（基于蛋白质-蛋白质相互作用网络分析）确定PKCδ/MAPK是XHF调控的更重要靶点。结果表明，XHF和Rottlerin均能有效抑制TGF-β1诱导的PKCδ酪氨酸311（Tyr311）磷酸化位点的激活，并显著抑制c-Jun氨基末端激酶（JNK）、细胞外调节蛋白激酶（ERK）和p38丝裂原活化蛋白激酶的磷酸化水平（图4I–M）。在5/6（A/I）肾切除模型大鼠肾组织中也观察到类似结果（图5A–E）。总体而言，这些数据表明，XHF主要通过抑制PKCδ磷酸化和随后的MAPK通路抑制来减轻肾纤维化。

图4. XHF改善TGF-β1诱导的人近端肾小管上皮细胞纤维化并调节PKCδ及其信号通路。（*P<0.05，**P<0.01，与对照组相比；#P<0.05，##P<0.01，与TGF-β1组相比）

图5. XHF减弱5/6（A/I）肾切除诱导的慢性肾脏病大鼠肾组织中PKCδ激活和下游信号通路。(**P<0.01，与假手术组相比；##P<0.01，与5/6（A/I）组相比。)

5.XHF通过抑制5/6（A/I）大鼠的内质网应激与细胞衰老来改善肾纤维化

在5/6肾切除大鼠中，XHF显著降低内质网应激相关蛋白免疫球蛋白重链结合蛋白（BIP）和C/EBP同源蛋白（CHOP）、p53、p21、磷酸化核因子-κB（p-NF-κB）以及IL-6表达，减少肾组织中SA-β-gal阳性细胞数（图6A–J）。在HK-2细胞中，XHF和Rottlerin均能抑制TGF-β1诱导的BIP、CHOP、p21、p-NF-κB和IL-6表达，并减少SA-β-gal阳性细胞（图7A–I）。XHF 20μM和rottlerin的联合用药显示了二者可协同抑制p-PKCδ、p-NF-κB和IL-6的作用（图7J–M）。

图6. XHF减轻5/6（A/I）肾切除诱导的慢性肾脏病大鼠肾组织中的内质网应激、细胞衰老和衰老相关分泌表型相关炎症（*P<0.05，**P<0.01，与假手术组相比；##P<0.01，与5/6（A/I）组相比）

图7. XHF减轻转化生长因子-β1诱导的人近端肾小管上皮细胞内质网应激和细胞衰老

讨论

本研究通过整合网络药理学与实验验证，确定了PKCδ是XHF的关键潜在靶点，首次揭示XHF通过抑制PKCδ/MAPK信号通路减轻肾小管上皮细胞衰老，从而延缓肾间质纤维化的机制。研究人员在5/6肾切除大鼠和TGF-β1诱导的HK-2细胞模型中均观察到XHF显著抑制PKCδ磷酸化，进而下调MAPK信号通路（JNK、ERK、p38）和NF-κB活化，减少IL-6等关键衰老相关分泌表型（SASP）因子分泌，最终缓解细胞衰老和纤维化表型。

细胞衰老在CKD进展中扮演关键角色。衰老细胞通过p53/p21通路停滞细胞周期，分泌IL-6、TGF-β1等因子，促进炎症和ECM沉积，形成纤维化微环境。PKCδ作为上游激酶，在CKD患者和动物模型中表达上调，其激活可促进线粒体功能障碍、细胞凋亡和SASP分泌。本研究证实XHF通过抑制PKCδ磷酸化，阻断其下游MAPK/NF-κB/IL-6信号轴，从而干预衰老-纤维化恶性循环。

尽管网络药理学提示AGE-RAGE通路可能参与XHF作用，但实验验证更支持PKCδ/MAPK通路的主导地位。Rottlerin的药理学验证进一步支持PKCδ的核心作用，但其脱靶效应仍需通过基因敲减等遗传学手段进一步验证。

结论

本研究表明，PKCδ是XHF的关键潜在靶点，其通过抑制PKCδ/MAPK信号通路，减轻内质网应激与肾小管上皮细胞衰老，显著改善肾间质纤维化和减轻肾功能损伤。其作用机制涉及降低SASP因子分泌、抑制炎症反应及恢复肾小管功能。作为一种传统中药复方，XHF展现出良好的应用前景，有望成为CKD抗纤维化治疗的潜在候选方案。未来仍需开展临床验证及基因水平研究，以进一步阐明其分子作用网络及长期疗效。

来源：Drug Des Devel Ther. 2025 Aug 13:19:6991-7004. doi: 10.2147/DDDT.S522318. eCollection 2025.